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분석 몰흡광계수 계산 문제 질문입니다 – ☞ 화학 (비댓 금지) – 물♡화♡생♡지

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280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient)

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280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient) 본문

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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%

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흡광, 흡광 측정, 흡광 assay란 | Molecular Devices

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• Summary of article content: Articles about 흡광, 흡광 측정, 흡광 assay란 | Molecular Devices 이때, ε은 몰 흡수도 또는 몰 흡광 계수로, 단위는 L mol-1 cm-1입니다. c는 mol/L로 표시된 용액의 용질의 농도입니다. p는 샘플의 경로 길이로, 큐벳 1cm와 같이 cm … …
• Most searched keywords: Whether you are looking for 흡광, 흡광 측정, 흡광 assay란 | Molecular Devices 이때, ε은 몰 흡수도 또는 몰 흡광 계수로, 단위는 L mol-1 cm-1입니다. c는 mol/L로 표시된 용액의 용질의 농도입니다. p는 샘플의 경로 길이로, 큐벳 1cm와 같이 cm … 광학밀도라고도 알려져 있는 흡광은 용액에 의해 흡수되는 빛의 양입니다. 흡광 수식, 흡광 측정, 흡광 assay, 실제 응용 분야에 대해 더 알아보세요.흡광이란, 흡광 수식, 흡광 측정, 흡광 Assay, 흡광도(Absorbance) 측정, 흡광 ELISA 프로토콜
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[결과보고서] Beer’s law and characteristics of various spectrophotometers (흡광도 측정과 Beer’s law)

세 가지(646.6nm/663.6nm/750nm) 파장을 통해서 Chl의 양을 정량 분석할 수 있는 이유는 이렇다.

엽록소a의 최대 흡수 파장은 663.6nm이고, 엽록소b의 최대 흡수 파장은 646.6nm이라는 실험적인 결과에 의해서 ①에서 사용된 식을 구할 수 있었다. 663.6nm의 파장이더라도 엽록소a 뿐만 아니라 엽록소b 또한 초기에 입사된 빛을 미량 흡수하게 된다. 이러한 사실이 식에 반영되어서 곱해지는 계수가 Chl a를 정량하는 식에서 각각 12.25, 2.55로 5배정도 차이남을 확인할 수 있으며, 다른 식에서도 특정한 비율로 계수의 차이가 확인된다. 또한 일반적으로 빛(백색광)이 물질에 닿으면 그 빛은 ①반사 ②흡수 ③통과하는 빛으로 나누어진다. 이 때 물질에 의해 흡수되는 빛의 양 (흡광도)은 물질에 농도에 따라 다르다. 이와 같은 빛의 흡수현상을 일정한 파장에서 시료용액의 흡광도를 측정하면 그 파장에서 빛을 흡수하는 물질의 양을 정량할 수 있다.

2. Step1에서 확인한 Beer’s Law를 자신이 추출한 Chl의 Abs값을 통하여 나타내보고, 이를 통해서 샘플의 정량 분석 시에 주의해야 할 점에 대해서 토의해 본다.

위 그래프는 세 가지 파장(646.6nm/663.6nm/750nm)에서 sample의 농도에 따른 흡광도의 변화를 나타낸 것이다. 이론적으로 sample의 농도가 증가됨에 따라 sample에 함유된 엽록소 a,b의 양 또한 함께 증가할 것이고 따라서 더 많은 빛이 흡수될 것임을 예상할 수 있다. It / Io = t 를 투과도, log(1/t) = A를 흡광도라 할 때 sample의 농도가 증가할수록 It의 값은 작아지게 되고 따라서 투과도 t의 값 또한 감소한다.

이에 A 흡광도의 값은 증가하게 될 것이다. 먼저 3개의 파장에서의 흡광도 변화 곡선을 전체적으로 살펴보면 예상결과와 일치하게 sample의 농도가 70%까지 증가됨에 따라 대체적으로 흡광도도 증가됨을 알 수 있다. 하지만 750nm의 파장에서 농도가 100%까지 증가될수록 이론과는 다르게 흡광도가 감소한다.

시료 중 흡광물질의 농도가 매우 높거나 낮으면 이 때의 흡광도는 Beer’s law를 따르지 않는다. 이와 같은 편차는 일반적으로 농도 변화에 따른 화합물의 본질 변화에 기인한다고 할 수 있다. 예를 들면 용액에서 어떤 산·염기·염 등은 농도가 희석될수록 그들의 이온화가 증가되는데, 이들 이온의 빛을 흡수하는 정도는 이온화되지 않는 분자의 그것과 다르다. 또한 어떤 유기화합물은 농도가 변화함에 따라 응집되는 경향이 있다. 따라서 흡광도를 측정한 때에는 표준용액을 사용하여 standard curve(표준곡선)를 얻은 후에 Beer’s law가 적용되는, 즉 물질의 농도가 흡광도가 정의 상관관계를 나타내는 범위의 농도에서 흡광도를 측정하여야 한다. 4)

이러한 경향에 다르게 663.6nm 파장에서의 붉은색 그래프와 646.6nm에서의 푸른색 그래프는 다시 흡광도가 90%에서 100%로 sample 농도가 증가함에 따라 같이 증가한다. 이러한 결과에 영향을 미친 요인으로는 원심분리 후 침전물을 제외한 pure한 용액만을 적정하여야하는데, sample을 pipette을 사용하지 않고 서로 섞어주는 행동을 하여 침전물이 섞여 들어갔을 가능성을 생각해 볼 수 있다. 또한, 큐벳의 불투명한 면만을 손으로 잡아 흡광도에 영향을 미치지 않아야하지만 측정과정 중 실수로 투명한 부분을 잡았을 가능성, sample의 적정을 정확히 하지 않았을 가능성을 생각해볼 수 있다. 따라서 이상적인 곡선을 얻기 위해서는 흡광도에 변화를 줄 요인(chlorophyll)을 제외한 다른 불순물이 들어가지 않도록 적정 시 주의를 기울여야하고, 큐벳의 불투명한 면만을 손으로 잡도록 해야 하며, 큐벳을 세척할 때 증류수로 먼저 세척 후, 측정하려는 용액으로 다시 한 번 씻어주어 미세한 농도의 변화도 막아주어야 한다. 또한 spectrophotometer 사용 시, 측정자 이외의 다른 사람들은 멀리 떨어져 미세한 빛의 변화에도 주의를 기울여야한다.

3. Step2에서 결정한 Nanodrop의 path-length를 계산하고, 어떻게 결정할 수 있었는지 토의해 본다. 그리고 각각의 spectrometer를 이용할 때, 주의해야 할 점에 대해서 작성해본다.

step2에서는 original solution의 흡광도를 Perkin Elmer와 Nanodrop 두 종류의 spectrophotometer를 사용하여 측정하였다. 큐벳의 길이를 1cm라고 알고 있는 상태에서 Beer’s law 즉, A= εcl에서 흡광도 A와 cuvette의 길이 l 값을 대입 할 수 있으며 농도 c는 Nanodrop에서도 동일하므로 계산에서 제외시킬 수 있다. 따라서 흡광계수 ε는 동일한 분자에서 같은 값을 가진다는 사실을 기반으로 다음과 같은 식을 이용하여 미지의 nanodrop cuvette의 길이를 추정할 수 있다.

Perkin Elmer에서의 Beer’s law

A = εcchla+bℓ

Nanodrop 에서의 Beer’s law

A’ = εcchla+bℓ’

두 개의 식에서 상수를 제외한 변수를 이항하여 식을 정리하면

A/ℓ = εcchla+b = A’/ℓ’

A/ℓ = A’/ℓ’

ℓ의 값은 1cm로 알고 있으므로 대입 후 구하고자 하는 값인 ℓ’ 에 대하여 다시 식을 정리하면,

ℓ’ = A’/A

step2에서 측정한 각 파장별 결과 값을 대입하여 ℓ’을 구하면,

646.6nm 파장에서 ℓ’= 0.010/0.129 = 0.0775

663.6nm 파장에서 ℓ’= 0.198/0.015 = 0.0758

따라서 두 값의 평균값인

ℓ’ = (0.0775+0.0758)/2 = 0.07665을 Nanodrop cuvette의 길이라 예측할 수 있다.

Perkin Elmer spectrophotometer 사용 시 주의해야할 사항은 이렇다. UV를 사용하는 기기이므로 가급적 빛에 노출되지 않도록 조심해야한다. 또한 정확한 흡광도를 측정하기 위해서는 cuvette의 불투명한면만을 잡음으로써 빛의 투과도에 영향을 주어선 안되고, cuvette을 증류수로 세척 후 측정하고자하는 sample로 다시 한번 헹구어줌으로써 미량의 농도변화도 방지한다. 최대한 외부의 빛이 실험결과에 영향을 미치지 않도록 너무 밝은 곳에서 실험을 진행하지 않아야하며, 흡광도 측정 시 작업자 이외의 다른 사람들은 조금 떨어진 거리에서 대기하여야 한다.

Nanodrop 사용 시 주의해야할 사항은 이렇다. 자외선을 사용하는 기기이기 때문에 인체에 해로울 수 있으므로 켜져 있는 램프를 가급적 쳐다보지 않아야 한다. 또한 사용되는 용매가 기체 상태의 부식성 샘플이 있기 때문에 기기의 근처에 용매나 가연성 샘플을 두면 안된다. 작업장의 환기도 수시로 해줄 필요가 있다. 작업자는 감염성이 있는 물질을 다루기 전에 관련 교육을 받아야하며 반드시 보호 장구를 착용하고 실험을 진행해야 한다. 마지막으로 다이어프램의 느슨해짐을 방지하기 위해서 HCl, 알코올, 표백제, 아세톤 또는 기타 용제가 다이어프램에 1 분 이상 남겨져 있지 않게 하여야한다.5)

4. Step3에서 얻은 흡광계수와 기존의 흡광계수를 비교해 본다.

A = εcℓ로 표현되는 Beer’s law를 사용하여, Chl a 와 Chl b가 혼합된 용액에서 각각의 ε 흡광계수를 알고 있는 값인 농도 c와 ℓ을 대입함으로써 연립방정식을 풀어서 구할 수 있다. 과정은 다음과 같다.

농도가 높을 때의 Chl의 농도와 흡광도

Chl a = 19.1 / Chl b = 7.8

A646.6nm = 0.8 / A663.6nm = 1.7

농도가 낮을 때의 Chl의 농도와 흡광도

Chl a = 16 / Chl b = 6.5

A646.6nm = 0.6 / A663.6nm = 1.4

우선, 파장 646.6nm 에서의 값들을 이용하여 미지의 흡광계수를 구해본다.

Aλ = AλM + AλN = ελMℓ[M] + ελNℓ[N]

= (ελMℓ[M] + ελNℓ[N])ℓ

A646.6nm = εacaℓa + εbcbℓb

여기서 ℓ의 값은 1cm 로 알고 있으며, 주어진 파장 646.6nm에서의 농도 c와 흡광도 A를 대입하여 두 개의 식을 얻고 연립방정식을 푼다.

0.8 = εa x 19.1 x 1 + εb x 7.8 x 1 —– ①

0.6 = εa x 16 x 1 + εb x 6.5 x 1 —– ②

② 식을 εa 에 관해 풀면

εa = (0.6 – εb x 6.5)/16

정리된 식을 ① 식에 대입해주면,

0.8 = {(0.6 – εb x 6.5)/16} x 19.1 + εb x 7.8

따라서 εb = 2.1

이 값을 ① 식에 다시 대입 해주면,

εa = -0.82 을 구할 수 있다.

다음으로, 파장 663.6nm 에서의 값들을 이용하여 미지의 흡광계수를 구해본다.

A663.6nm = εacaℓa + εbcbℓb

1.7 = εa x 19.1 x 1 + εb x 7.8 x 1 —– ①

1.4 = εa x 16 x 1 + εb x 6.5 x 1 —– ②

② 식을 εa 에 관해 풀면

εa = (1.4 – εb x 6.5)/16

정리된 식을 ① 식에 대입해주면,

1.7 = {(1.4 – εb x 6.5)/16} x 19.1 + εb x 7.8

따라서 εb = 0.75

이 값을 ① 식에 다시 대입 해주면,

εa = -0.22 를 구할 수 있다.

정리하면, 파장 646.6nm에서의 흡광계수는

εa = -0.82 / εb = 2.1

파장 663.6nm에서의 흡광계수는

εa = -0.22 / εb = 0.75

Problem 10.

다음 연립방정식을 푼다.

0.8 = 16.75 x Ca + 45.6 x Cb — ①

1.7 = 82.04 x Ca + 9.27 x Cb — ②

② 번식을 Ca에 대하여 정리하면

Ca = (1.7 – 9.27 x Cb)/82.04

이를 식 ①에 대입하면,

0.8 = 16.75/82.04(1.7 – 9.27 x Cb) + 45.6 x Cb

따라서 Cb = 0.0104 이를 식 ①에 다시 대입하면,

Ca= 0.0194 이다.

■ Conclusion

Step1에서 진행된 실험으로 sample 내의 흡광물질의 농도 변화에 따른 흡광도의 변화를 살펴볼 수 있었다. 이론적으로 흡광물질의 농도가 증가할수록 흡광도 또한 증가하게 된다. 왜냐하면, 투사된 빛이 흡광물질에 의해 특정한 파장이 흡수되기 때문이다. 따라서 이상적으로는 y=ax의 그래프가 예상이 되었지만, 실제적인 실험 결과 대체적으로 70% 농도까지는 흡광도가 증가하다가 그 이후 90%까지는 다시 감소, 100% 까지는 다시 증가하는 모양의 그래프를 얻어 냈다. sample의 농도가 매우 높아질 때, 이온화와 응집이라는 새로운 사건으로 화합물의 흡광도가 변화될 수 있으며 따라서 많은 물질이 높은 농도에서는 Beer’s law를 따르지 않는다는 사실에 입각하여 다시 그래프를 해석해 볼 때, 70%에서 90%로 sample의 농도가 증가할 때 흡광도가 감소하는 경향을 보이는 것이 타당해 보인다. 하지만 그 이후 90%에서 100%로의 농도증가 시 흡광도의 증가는 예상과는 다른 결과이며, 적정의 오류, 기타 앞서 추측한 실수들의 오차라고 생각이 되어진다.

step2에서 진행된 실험으로 Perkin Elmer의 측정결과로 얻어낸 흡광도를 사용하여 Nanodrop의 미지의 cuvette길이를 추정할 수 있었으며, 이를 가능하게 한 사실은 Beer’s law에서 같은 흡광물질의 흡광계수는 동일하다라는 전제였다.

이번 실험을 통해 spectrophotometer의 하나인 Perkin Elmer와 Nanodrop의 사용법을 익히고 Beer’s law를 이해하였으며, 이를 이용하여 시료 속의 흡광물질의 농도를 결정하는 방법을 익힐 수 있었다.

■ Reference

1) 이병인, 2005, basic 고교생을 위한 생물 용어사전, ch 18 p35.

2)국제환경규제대응기술지원센터, KITECH 한국생산기술연구원.http://www.ecolab.re.kr/home/chemical/ machine.php

3) 동서라인텍, DS LINETECH. http://www.dslinetech. com/sub/sub03_03_08.php

4) 범문 에듀케이션, Virtual-LAB. http://www.virtual- lab.or.kr/demo/Experiment_PnP.asp?gCNum=10401

5)ThermoFisherSCIENTIFIC,ThermoFisher SCIENTIFIC. https://assets.thermofisher.com/TFS- Assets/CAD/manuals/3091-NanoDrop-One-User-Guide-v1.3-sw-KOREAN

280nm에서 단백질 흡광계수 이론적으로 계산하기 (Extinction coefficient)

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1. 서론

생물공학 실험에서 분광기(Spectrophotoscopy)를 이용하여 흡광계수(Extinction coefficient)를 정확히 측정하는 것은 중요합니다.

비어 람버트 식(Beer Lambert equation)을 통해 흡광도(A), 흡광계수(ε), 농도(C), 셀 길이(L)를 구할 수 있습니다.

비어 람버트 식: A = εCL

일반적으로, 분광기(Spectrophotoscopy)를 사용하여 흡광도(A)를 측정하고, 측정했던 농도(C)를 알고 있기 때문에

Standard curve를 그리고, 기울기를 측정하여 해당 단백질의 흡광계수(ε)를 측정할 수 있습니다.

특히, 단백질의 경우 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 시스테인(Cys) 등 아미노산이 280nm에서 흡광도를 나타내는데 중요한 역할을 합니다.

2. 흡광계수 이론적 예측의 필요성

해당 시료가 없어 당장 실험을 진행할 수 없거나, 시료가 너무 적어 실험을 진행하기 어려울 경우

280nm에서 단백질의 흡광계수(ε)를 이론적으로 계산하고 우리가 원하는 영역의 흡광도(A)를 나타낼 수 있습니다.

비어 람버트 식: A = εCL

예를 들어, 해당 시료의 흡광도(A)를 1로 나타내고 싶다면,

비어 람버트 식: 1 = εCL

C = 1 / εL

로 흡광계수(ε)만 알 수 있다면 실험에 필요한 농도를 특정할 수 있습니다.

(물론, 가장 빠른 방법은 280nm에서 흡광계수(ε)의 Reference를 찾는 것입니다.)

3. 흡광계수 이론적 예측

https://www.rcsb.org/

PDB bank에서 흡광계수 예측을 위한 단백질 코드(Sequence)를 불러옵니다.

예를 들어, T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 아미노산 코드입니다.

SEQRES 1 A 164 MET ASN ILE PHE GLU MET LEU ARG ILE ASP GLU GLY LEU

SEQRES 2 A 164 ARG LEU LYS ILE TYR LYS ASP THR GLU GLY TYR TYR THR

SEQRES 3 A 164 ILE GLY ILE GLY HIS LEU LEU THR LYS SER PRO SER LEU

SEQRES 4 A 164 ASN ALA ALA LYS SER GLU LEU ASP LYS ALA ILE GLY ARG

SEQRES 5 A 164 ASN CYS ASN GLY VAL ILE THR LYS ASP GLU ALA GLU LYS

SEQRES 6 A 164 LEU PHE ASN GLN ASP VAL ASP ALA ALA VAL ARG GLY ILE

SEQRES 7 A 164 LEU ARG ASN ALA LYS LEU LYS PRO VAL TYR ASP SER LEU

SEQRES 8 A 164 ASP ALA VAL ARG ARG CYS ALA LEU ILE ASN MET VAL PHE

SEQRES 9 A 164 GLN MET GLY GLU THR GLY VAL ALA GLY PHE THR ASN SER

SEQRES 10 A 164 LEU ARG MET LEU GLN GLN LYS ARG TRP ASP GLU ALA ALA

SEQRES 11 A 164 VAL ASN LEU ALA LYS SER ARG TRP TYR ASN GLN THR PRO

SEQRES 12 A 164 ASN ARG ALA LYS ARG VAL ILE THR THR PHE ARG THR GLY

SEQRES 13 A 164 THR TRP ASP ALA TYR LYS ASN LEU

280nm에서 흡광도를 나타내는 트립토판(Trp), 타이로신(Tyr), 시스테인(Cys)의 개수를 세어줍니다.

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 경우

트립토판(Trp): 3개

타이로신(Tyr): 5개

시스테인(Cys): 2개

흡광계수(ε) (280nm) = 트립토판(Trp) * 5500 + 타이로신(Tyr) * 1490 + 시스테인(Cys) * 125

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 경우

흡광계수(ε) (280nm) = 3 * 5500 + 5 * 1490 + 2 * 125 = 24200

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 흡광계수(ε)는 24200M-1cm-1로 예측되었습니다.

3. 흡광계수 이론적 예측과 실험적 실제 값 비교

실제로, T4 Lysozyme(라이소자임)의 흡광계수(ε)는 24227M-1cm-1로

T4 Lysozyme(라이소자임) 6LZM.pdb의 흡광계수(ε) 예측값인 24200M-1cm-1과 비슷하게 예측되었습니다.

따라서,

비어 람버트 식: A = εCL

비어 람버트 식에 적용하여 흡광도 1로 측정되도록 하고 싶다면

비어 람버트 식: 1 = εCL

비어 람버트 식: C = 1 / εL = 1 / 24200

C = 0.041 mM

결국, 0.041mM의 농도로 T4 Lysozyme(라이소자임)을 분광기(Spectrophotoscopy)로 측정하면

흡광도 1에 가까운 값을 구할 수 있습니다.

4. 참고자료

Gill, Stanley C., and Peter H. Von Hippel. “Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.” Analytical biochemistry 182.2 (1989): 319-326.

Pace, C. Nick, et al. “How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.” Protein science 4.11 (1995): 2411-2423.

Anders, John C., et al. “Using amino acid analysis to determine absorptivity constants: A validation case study using bovine serum albumin.” Biopharm international 16 (2003): 30-43.

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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%

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Beer-Lambert Law. 1.50 cm 3.75 mg/100 mL 480 nm 39.6%

1.50 cm의 셀에 들어있는 3.75 mg/100 mL A (분자량 220 g/mol) 용액은

480 nm에서 39.6%의 투광도를 나타내었다.

A의 몰흡광계수는?

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Beer-Lambert Law. 비어-람베르트 법칙

A = εbC

> ε의 단위: M^-1 cm^-1

> b의 단위: cm

> C의 단위: M

용액의 몰농도를 계산하면,

(3.75/1000 g) / (220 g/mol) / 0.100 L

= 0.00017045 mol/L

= 0.00017045 M

%T = 39.6%

—> T = (39.6/100) = 0.396

A = –log(T)

= –log(0.396)

= 0.4023

ε = A / bC

= 0.4023 / (1.50 × 0.00017045)

= 1573.48

= 1.57×10^3

답: 1.57×10^3

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[키워드] 비어 램버트 법칙 기준문서, 비어 기준문서

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